一、荧光定量PCR技术简介及原理
荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，从而对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR过程中，荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。实时荧光定量PCR技术是一次DNA定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA 、RNA样品进行定量和定性分析。
二、荧光定量PCR技术应用领域
临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
动物疾病检测：禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。
食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。
科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
三、荧光定量PCR技术服务内容
服务名称 内容说明
qPCR—引物设计 引物设计
qPCR—构建标准品 用于绝对定量的标准品
qPCR—标准曲线制备 用浓度梯度标准品进行定量，计算得到标准曲线
qPCR—相对定量 每个样品重复三次，内参重复三次，包含反转录、引物合成费用、内参基因费用
qPCR—绝对定量 含标准品、标曲等
四、实验要求
客户提供：
1.进行mRNA表达量分析时，如果提供的材料为Total RNA，请寄送足量的并且保证纯度的Total RNA(浓度在200 ng/μl以上，体积在20 μl
以上，纯度A260/280在1.8-2.0间)。如果目的基因表达量低时，应尽量提供更高浓度的Total RNA。
2.如果提供的材料为细胞或组织，DNA、RNA的提取费用另收。 同时应保证材料新鲜，动物细胞数为106以上，动物组织为100 mg以上。 3.目的基因信息(GenBank Acc、Gene ID、关键词)，mRNA需说明具体剪接子及检测范围（公共区域或特异性区域）。
4.引物设计的区域范围(全序列、5′端序列、3′端序列)。
公司提供：样品质检报告、实验设计报告、定量结果报告（扩增反应报告、溶解曲线报告和荧光定量数据结果及柱状图）。
五、注意事项及常见问题
Q: 如何选择合适的内参基因？
A：常见物种做mRNA使用actin做内参，miRNA检测使用U6做内参，特殊物种根据文献选择合适的内参。对于一些无法确定内参的物种，我们可以提供内参基因筛选服务，选出稳定的内参用于后续实验。
Q: 引物出现非特异怎么解决？
A：提高退火温度；减少引物量；重新设计引物。
Q: 绝对定量与相对定量有什么区别？
A：绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。
荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，从而对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR过程中，荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。实时荧光定量PCR技术是一次DNA定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA 、RNA样品进行定量和定性分析。
二、荧光定量PCR技术应用领域
临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
动物疾病检测：禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。
食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。
科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
三、荧光定量PCR技术服务内容
服务名称 内容说明
qPCR—引物设计 引物设计
qPCR—构建标准品 用于绝对定量的标准品
qPCR—标准曲线制备 用浓度梯度标准品进行定量，计算得到标准曲线
qPCR—相对定量 每个样品重复三次，内参重复三次，包含反转录、引物合成费用、内参基因费用
qPCR—绝对定量 含标准品、标曲等
四、实验要求
客户提供：
1.进行mRNA表达量分析时，如果提供的材料为Total RNA，请寄送足量的并且保证纯度的Total RNA(浓度在200 ng/μl以上，体积在20 μl
以上，纯度A260/280在1.8-2.0间)。如果目的基因表达量低时，应尽量提供更高浓度的Total RNA。
2.如果提供的材料为细胞或组织，DNA、RNA的提取费用另收。 同时应保证材料新鲜，动物细胞数为106以上，动物组织为100 mg以上。 3.目的基因信息(GenBank Acc、Gene ID、关键词)，mRNA需说明具体剪接子及检测范围（公共区域或特异性区域）。
4.引物设计的区域范围(全序列、5′端序列、3′端序列)。
公司提供：样品质检报告、实验设计报告、定量结果报告（扩增反应报告、溶解曲线报告和荧光定量数据结果及柱状图）。
五、注意事项及常见问题
Q: 如何选择合适的内参基因？
A：常见物种做mRNA使用actin做内参，miRNA检测使用U6做内参，特殊物种根据文献选择合适的内参。对于一些无法确定内参的物种，我们可以提供内参基因筛选服务，选出稳定的内参用于后续实验。
Q: 引物出现非特异怎么解决？
A：提高退火温度；减少引物量；重新设计引物。
Q: 绝对定量与相对定量有什么区别？
A：绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。
