DNA显微注射实验服务项目简介
显微注射法（microinjection）是利用显微操作技术，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，导致宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象，而使外源基因嵌入宿主的染色体内。这种技术的长处在于任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等转基因动物。
DNA显微注射实验流程
一、导入DNA的制备程序如下：
1） 通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA，用5mg/ml溴化乙啶染色。
2） 为防止对插入DNA的溴化乙啶的破坏，用长波紫外光显影。
3） 切下目的基因所在凝胶片，电泳制备目的DNA，或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。
4） 乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀，再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。
5） -200C 孵育过夜后，超速离心机10000转/分，离心5分，收集沉淀，重悬沉淀于Elutip缓冲液。
6） 用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。
7） 按照步骤4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要，因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。
8） 注射缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重悬沉淀，缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制。
9） 通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度。
10） 用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/ul。
二、受精卵的显微注射
1） 置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦。
2） 调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜（32X）下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。
3） 挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界。在注射前，增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状，以此确定DNA溶液流存在。
4） 如果未见DNA溶液流，则轻轻摩擦持样器钝缘，渐渐的打开注射器针头。针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在。
5） 移动持卵管回到受精卵下部。通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必须确保受精卵基底部与凹玻片基底部轻轻接触。注意不宜吸得过紧，否则会使卵变形，甚至会将卵吸人持卵器内。
6） 对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端。
7） 维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，进行调节并使针与原核处于同一平面上。用注射针依次刺破透明带，细胞外膜，前核核膜，进入核膜内，受精卵的透明带易被针尖刺破，前核核膜相当有弹性，应用不同的方法进行尝试突破此结构。操作时避免与核接触损伤核仁。
8） 保持注射针位置固定，轻轻增加压力使DNA溶液流入前核中。注射过程中可能出现的现象如下：
① 注射后原核将膨大到原来的两倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射针。
② 一气泡出现在注射针尖端，透明带可能膨胀，表明受精卵的膜非常艰固，没有被刺破，此时需继续向内进针，直到尖端进入核，同时要小心注射针尖端极易破损。
③ 注射针压力较大，看不到任何现象，可能是注射针堵塞，需换针或更换DNA溶液。
④ 若见胞质颗粒涌出到卵黄周围空间，说明受精卵破裂。注射过程中，发现卵破裂数目较多，则需更换注射针。一支注射针一般可注射5—10枚卵。
9） 用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置，以区分注射组与非注射组。重新安装持卵管并进行下一组操作。
三、受精卵的输卵管转移
（1）受精卵的输卵管注射
1）将麻醉小鼠放置于一塑料平皿盖上，固定小鼠牙齿于皿缘以确保小鼠气道通畅。用70%乙醇涂搽切口部位。也可预先在手术部位剔除毛发。
2）将受精卵从培养液转移至工作液内。因受精卵在转移过程中在孵箱外操作，所以应该将其从培养基中移到工作液中。
3） 用移卵管装载受精卵。移卵管的正确装载对输卵管转移的成功非常重要。如图11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些许空气制成一个小气泡。再吸取与气泡体积大约相当的工作液，紧接着在吸取另外一个小气泡。收集受精卵于尽可能小容积的工作液中，将其线形排列于移卵管中。当所有的卵被负载后，再吸取小量气体制成小气泡，接着吸取最终容量的工作液。气泡将有利于对压力进行调节，更容易使卵移动。
4） 手术暴露输卵管复合体。如图所示，在离中线约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作横行切口。仔细用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛发。捏住一侧切口皮肤，钝性分离皮下组织。移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见。这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁，并作约0.5厘米横行切口，钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢、输卵管以及子宫。用弹簧夹夹住脂肪垫并保持子宫在适当位置。若子宫及子宫角频繁滑回腹腔，在保证气道通畅的前提下，可适当重新布置其位置。
5） 轻轻移动塑料平皿，使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管卷曲部清晰可见。
6） 用眼科镊于漏斗部透明囊膜处钝性撕开小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部应用肾上腺素以减少出血，并用纱布擦拭保持操作视野干净。
7） 一旦漏斗部清晰可见，用镊子夹持其边缘并充分暴露漏斗管口。在避免壶腹损伤的前提下，尽可能插入移卵管。
8） 在压力可调节的前提下，轻轻把卵吸吹进入漏斗部。气泡可以阻止卵回流而且很容易使卵进入输卵管漏斗管。若吹卵的压力太大，那么移卵管口可能抵在输卵管壁上，这时可稍微后撤移卵管再进行操作，也可能由于血块堵塞移卵管，若这样，则应该吹出细胞在培养皿中，重新吸卵。
9） 移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置将各器官重置于腹腔内。
10）缝合切口，用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线，这样可以避免小鼠啃嘶缝线，切口裂开。
11）若进行双侧手术，则于另一侧子宫角重复上述操作。
12）手术完成后，安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下，小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子，所以对受体母鼠必须严格监护。
显微注射的优缺点
以显微注射法转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞。这些操作中所使用的微量移液管是用毛细管拉针器(pipettepuller)来制作的，先将玻璃毛细管加热到其熔化的温度，再将其拉制成所需的合适大小的直径和锥形，微量移液管小头的直径（小至0.2微米）与纤维操纵器的高精度相关，它可以用于精准的移液。这种精确度可以为各种类型和任意大小的细胞提供亚皮克升级或0.1微米(micron)范围内的精确的、重复性良好的细胞内和细胞旁注射。通过运用直接的水压（压力注射）或者不通过使用水流，而通过施加一电场来使带电离子运动（离子电渗法），都可以获得将微量移液管中的物质挤喷出去的效果。
显微注射法（microinjection）是利用显微操作技术，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，导致宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象，而使外源基因嵌入宿主的染色体内。这种技术的长处在于任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等转基因动物。
DNA显微注射实验流程
一、导入DNA的制备程序如下：
1） 通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA，用5mg/ml溴化乙啶染色。
2） 为防止对插入DNA的溴化乙啶的破坏，用长波紫外光显影。
3） 切下目的基因所在凝胶片，电泳制备目的DNA，或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。
4） 乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀，再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。
5） -200C 孵育过夜后，超速离心机10000转/分，离心5分，收集沉淀，重悬沉淀于Elutip缓冲液。
6） 用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。
7） 按照步骤4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要，因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。
8） 注射缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重悬沉淀，缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制。
9） 通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度。
10） 用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/ul。
二、受精卵的显微注射
1） 置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦。
2） 调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜（32X）下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。
3） 挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界。在注射前，增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状，以此确定DNA溶液流存在。
4） 如果未见DNA溶液流，则轻轻摩擦持样器钝缘，渐渐的打开注射器针头。针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在。
5） 移动持卵管回到受精卵下部。通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必须确保受精卵基底部与凹玻片基底部轻轻接触。注意不宜吸得过紧，否则会使卵变形，甚至会将卵吸人持卵器内。
6） 对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端。
7） 维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，进行调节并使针与原核处于同一平面上。用注射针依次刺破透明带，细胞外膜，前核核膜，进入核膜内，受精卵的透明带易被针尖刺破，前核核膜相当有弹性，应用不同的方法进行尝试突破此结构。操作时避免与核接触损伤核仁。
8） 保持注射针位置固定，轻轻增加压力使DNA溶液流入前核中。注射过程中可能出现的现象如下：
① 注射后原核将膨大到原来的两倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射针。
② 一气泡出现在注射针尖端，透明带可能膨胀，表明受精卵的膜非常艰固，没有被刺破，此时需继续向内进针，直到尖端进入核，同时要小心注射针尖端极易破损。
③ 注射针压力较大，看不到任何现象，可能是注射针堵塞，需换针或更换DNA溶液。
④ 若见胞质颗粒涌出到卵黄周围空间，说明受精卵破裂。注射过程中，发现卵破裂数目较多，则需更换注射针。一支注射针一般可注射5—10枚卵。
9） 用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置，以区分注射组与非注射组。重新安装持卵管并进行下一组操作。
三、受精卵的输卵管转移
（1）受精卵的输卵管注射
1）将麻醉小鼠放置于一塑料平皿盖上，固定小鼠牙齿于皿缘以确保小鼠气道通畅。用70%乙醇涂搽切口部位。也可预先在手术部位剔除毛发。
2）将受精卵从培养液转移至工作液内。因受精卵在转移过程中在孵箱外操作，所以应该将其从培养基中移到工作液中。
3） 用移卵管装载受精卵。移卵管的正确装载对输卵管转移的成功非常重要。如图11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些许空气制成一个小气泡。再吸取与气泡体积大约相当的工作液，紧接着在吸取另外一个小气泡。收集受精卵于尽可能小容积的工作液中，将其线形排列于移卵管中。当所有的卵被负载后，再吸取小量气体制成小气泡，接着吸取最终容量的工作液。气泡将有利于对压力进行调节，更容易使卵移动。
4） 手术暴露输卵管复合体。如图所示，在离中线约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作横行切口。仔细用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛发。捏住一侧切口皮肤，钝性分离皮下组织。移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见。这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁，并作约0.5厘米横行切口，钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢、输卵管以及子宫。用弹簧夹夹住脂肪垫并保持子宫在适当位置。若子宫及子宫角频繁滑回腹腔，在保证气道通畅的前提下，可适当重新布置其位置。
5） 轻轻移动塑料平皿，使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管卷曲部清晰可见。
6） 用眼科镊于漏斗部透明囊膜处钝性撕开小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部应用肾上腺素以减少出血，并用纱布擦拭保持操作视野干净。
7） 一旦漏斗部清晰可见，用镊子夹持其边缘并充分暴露漏斗管口。在避免壶腹损伤的前提下，尽可能插入移卵管。
8） 在压力可调节的前提下，轻轻把卵吸吹进入漏斗部。气泡可以阻止卵回流而且很容易使卵进入输卵管漏斗管。若吹卵的压力太大，那么移卵管口可能抵在输卵管壁上，这时可稍微后撤移卵管再进行操作，也可能由于血块堵塞移卵管，若这样，则应该吹出细胞在培养皿中，重新吸卵。
9） 移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置将各器官重置于腹腔内。
10）缝合切口，用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线，这样可以避免小鼠啃嘶缝线，切口裂开。
11）若进行双侧手术，则于另一侧子宫角重复上述操作。
12）手术完成后，安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下，小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子，所以对受体母鼠必须严格监护。
显微注射的优缺点
以显微注射法转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞。这些操作中所使用的微量移液管是用毛细管拉针器(pipettepuller)来制作的，先将玻璃毛细管加热到其熔化的温度，再将其拉制成所需的合适大小的直径和锥形，微量移液管小头的直径（小至0.2微米）与纤维操纵器的高精度相关，它可以用于精准的移液。这种精确度可以为各种类型和任意大小的细胞提供亚皮克升级或0.1微米(micron)范围内的精确的、重复性良好的细胞内和细胞旁注射。通过运用直接的水压（压力注射）或者不通过使用水流，而通过施加一电场来使带电离子运动（离子电渗法），都可以获得将微量移液管中的物质挤喷出去的效果。
